今天喆圖小編來給大家講講用恒溫培養(yǎng)箱做蛋白定量濃度實(shí)驗(yàn)：

     1、吸棄培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液。

     2、往培養(yǎng)皿中加入2ml冷的PBS輕輕蕩洗2~3次，MAX后一次，吸干培養(yǎng)皿中的PBS。

     3、每個(gè)培養(yǎng)皿中加入70μl（以FLS細(xì)胞為例）裂解液。

裂解液的配置：

     RIPA裂解液：蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物：RIPA裂解液（中）B液=100：1：1

     4、將加入裂解液的培養(yǎng)皿輕輕搖晃，使裂解液與貼壁細(xì)胞充分接觸，放入—70℃的低溫冰箱，冷凍10分鐘。

     5、裂解完后，用干凈的刮刀將細(xì)胞刮于培養(yǎng)皿的一處，然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。

     6、將離心管置于小型離心機(jī)上渦旋一下，然后置于4℃低溫冰箱放置30min。

     7、將離心管放入高速離心機(jī)，于4度下12000rpm離心5min。

     8、取出離心管，吸取上清液，上清液即蛋白液，對(duì)其進(jìn)行定量，轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管。

     9、對(duì)提取的上清液進(jìn)行蛋白濃度的定量

蛋白定量的過程

     ①取干凈的96孔板，進(jìn)行區(qū)域選擇板底掃描即讀板

     ②首先在96孔板中加入18ul的PBS

     ③在18ul的PBS中加入2ul的樣品

     ④MAX后在加入200ul的BCA（加入后的BCA不進(jìn)行與樣品的混合，而是鋪在樣品的上面，用吹風(fēng)機(jī)除去上方的氣泡）

     BCA的配置：BCA試劑A：BCA試劑B=50：1

     ⑤放置37°恒溫培養(yǎng)箱孵育30min

     ⑥讀板（吸光光度值為562）

     10、對(duì)剩余的樣品按照體積5：1的比例加入Loading Buffer（6X）

     11、將加好的樣品放入離心機(jī)順離，使離心管內(nèi)壁的樣品甩下。

     12、將樣品放入恒溫金屬浴鍋中100℃煮7min

     13、將煮好的蛋白放入—20℃低溫冰箱中備用

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