在傳統(tǒng)的軟瓊脂克隆形成試驗中，細胞生長在上層含有細胞培養(yǎng)基的軟瓊脂中，下層軟瓊脂也與細胞培養(yǎng)基混合，但含有較高濃度的瓊脂。這可以防止細胞貼附在培養(yǎng)板上，還可以使轉(zhuǎn)化細胞形成可見的菌落。這種技術(shù)的原理是正常細胞依靠細胞與細胞外基質(zhì)的接觸才能生長和分裂，相反，不管周圍環(huán)境如何，轉(zhuǎn)化細胞均具有生長和分化的能力，因此能夠以錨定獨立的方式形成菌落的細胞被認為是轉(zhuǎn)化和致癌的。下面喆圖小編介紹一種用水浴鍋做相關(guān)實驗的方法，這種方法的總體目標(biāo)是以半定量和嚴(yán)格的方式測定細胞的這種能力。

        實驗操作：

準(zhǔn)備材料和試劑：

1、配制2×培養(yǎng)基：1 g培養(yǎng)基粉末，0.2 g碳酸氫鈉，加入去離子水，定容到50 mL。

2、將培養(yǎng)基經(jīng)0.2 μm濾膜過濾除菌。

3、加入目標(biāo)細胞所需培養(yǎng)基的其他成分。例如：用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)CMT 167細胞需要加入10% FBS，1% 青霉素/鏈霉素。使用之前將培養(yǎng)基放在37°C水浴鍋中。

4、配制1×培養(yǎng)基，依照目標(biāo)細胞生長所需培養(yǎng)基配制。

5、配制1%瓊脂：1 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。

6、配制0.6%瓊脂：0.6 g瓊脂加入到100 mL去離子水中。

7、將配好的瓊脂經(jīng)高溫高壓滅菌，滅菌后可放在4°C保存，使用前加熱至*溶解。

8、配制氯化硝基四氮唑藍試劑：1 mg/mL氯化硝基四氮唑藍加入到1×PBS中。

        鋪下膠：

1、將熔化的1%瓊脂溶液和預(yù)熱的2×培養(yǎng)基放入裝滿熱水（42°C）的桶（或水浴鍋）中，在熱水里放一個50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺內(nèi)。

2、6孔板中的每個孔需要加入1.5 mL混合的瓊脂和培養(yǎng)基，為保證足夠的量，一個6孔板準(zhǔn)備12 mL。

3、首先加入6 mL的培養(yǎng)液到50 mL的錐形管，再加入6 mL的1%瓊脂溶液。將錐形管多次翻轉(zhuǎn)混勻，每個孔中迅速加入1.5 mL混合液，加混合液時不能產(chǎn)生氣泡。

4、室溫靜置30 min，待下膠凝固。

        鋪上膠：

1、收獲的細胞用胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)基以1:5的比例稀釋（如1 mL胰蛋白酶，加4 mL培養(yǎng)基），放入15 mL錐形管。

2、細胞計數(shù)：以每孔5000個細胞作為起始，并根據(jù)需要進行調(diào)整。

3、細胞懸浮液的體積需要1.5 mL。一個6孔板準(zhǔn)備12 mL細胞懸液。

4、將熔化的0.6%瓊脂溶液放入裝有熱水（42°C）的桶中，在熱水里放一個50 mL的錐形管。將桶放入超凈臺內(nèi)。

5、以1:1的比例混合0.6%瓊脂溶液和細胞懸液，吸取6 mL細胞懸浮液到50 mL錐形管，再加入6 mL的0.6%瓊脂溶液。混勻后迅速加入6孔板中，每孔1.5 ml。小心避免產(chǎn)生氣泡。

6、室溫靜置30 min，待上膠凝固后放入細胞培養(yǎng)箱。

7、足夠的菌落形成所需的時間因每個細胞系而異，通常為21天左右。每星期加兩次100 g的培養(yǎng)基以防止干燥。

        以上內(nèi)容僅供參考，詳情請咨詢上海喆圖。